施一公研究组在《自然》发表论文报道人体γ-分泌酶原子分辨率三维结构

18.08.2015 11:14

本文来源: 清华大学

为理解老年痴呆症发病机理提供重要基础

清华新闻网8月18日电 8月18日，清华大学生命学院施一公教授研究团队在《自然》（ Nature ）在线发表了题为《人源γ-分泌酶的原子分辨率结构》（ An atomic structure of human γ-secretase ）的文章，报道了分辨率高达3.4埃的人体γ-分泌酶的电镜结构，并且基于结构分析研究了γ-分泌酶致病突变体的功能，为理解γ-分泌酶的工作机制以及阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)的发病机理提供了重要基础。

人体γ-分泌酶3.4埃三维结构。

阿尔兹海默症是一类神经退行性疾病，又称老年痴呆症，是当今世界面临的最为严峻的老年神经退行性疾病之一。临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块，神经元逐渐死亡，认知和记忆能力受损，病人逐渐丧失独立生活能力，最后脑功能严重受损直至死亡。美国前总统里根和英国前首相撒切尔夫人都罹患该疾病。统计结果表明，在65岁以上人群中，其发病率高达10%，在85岁以上人群中，发病率更是达到30-50%；我国目前患该病的人口高达500万，约占世界患者总数的四分之一，并且由于预防治疗手段不足，缺乏特效药物，该疾病逐渐有发病年龄提前，发病人数增加的趋势，不但给病人及家属造成极大痛苦，也同时为社会带来沉重负担。

尽管如此，阿尔兹海默症的发病机理尚有待揭示。目前研究已知β-淀粉样沉淀（β-amyloid）是该病的标志性症状之一。而β-淀粉样沉淀的产生是APP蛋白经过一系列蛋白酶切割产生的短肽聚集而来。在此切割过程中，最关键的蛋白酶是γ-分泌酶（γ-secretase）。γ-分泌酶由四个跨膜蛋白亚基组成，分别为Presenilin（PS1）、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。其中，编码PS1蛋白的基因中有200多个突变与AD病人相关，而PS1正是行使酶切功能的关键活性亚基。这些突变有可能导致PS1功能异常而引起阿尔兹海默症的发生。γ-分泌酶在阿尔兹海默症的发病中扮演着重要角色，很多药物的研发直接以γ-分泌酶作为靶点，希望通过调节其活性来治疗疾病。三维结构信息的缺失和突变致病机理的不明使得药物研发受到很大限制，所以获取其三维结构至关重要。但是γ-分泌酶是一个膜整合蛋白复合体，此前预测跨膜螺旋达到19个，其三维结构研究一直存在很多困难，瓶颈是获得性质良好适合结构生物学研究的重组蛋白复合体。

PS1与阿尔茨海默病相关突变的结构和生化分析。

施一公教授2006年在清华大学建设实验室之初，就将揭示阿尔兹海默症的发病机理作为重点研究方向，其中一个主要环节是解析γ-分泌酶的高分辨率结构，揭示Presenilin突变体的致病机理。他们经过长期不懈的努力，积累了大量经验教训，终于在近年取得一系列重要突破：

2012年12月，施一公研究组在《自然》（Li et al, Nature）报道PS1细菌同源蛋白PSH的晶体结构，并根据同源性首次构建了PS1的结构模型，揭示了PS1的结构折叠，并在结构上初步分析了在阿尔茨海默症病人中发现的PS1突变位点；

2014年6月，施一公研究组与英国MRC分子生物学实验室白晓晨博士和Sjors Scheres研究员合作在《自然》报道了分辨率为4.5埃的γ-分泌酶复合物电镜结构，观察到了其跨膜区域呈马蹄形排布的结构，但是受限于分辨率，无法准确区分各个亚基的具体排布（Lu et al, Nature）；

2014年9月，施一公研究组在《美国科学院院刊》（PNAS）发表文章，报道了其中一个亚基Nicastrin同源蛋白胞外结构域的高分辨率晶体结构，推测了Nicastrin在底物招募过程中可能的机制，并且根据同源性构建了人源Nicastrin 胞外结构域的结构，结合该结构与此前解析的PSH晶体结构和4.5埃分辨率电镜结构，他们在γ-分泌酶跨膜区辨认出了PS1，并进一步推测了该复合物近20个跨膜螺旋的组装模式，但该结论仍需高分辨率的结构验证（Xie et al, PNAS）；

2015年3月，施一公研究组在PNAS发表论文，报道PS1的细菌同源蛋白PSH具有与γ-分泌酶类似的底物切割活性，并且其酶活也受到γ-分泌酶小分子抑制剂的抑制，并解析了该抑制剂与PSH的复合物结构，揭示了其抑制位点，从而使得PSH可以作为一个研究成本相对低廉的替代品来进行γ-分泌酶调控小分子的初步筛选（Dang et al, PNAS）；

2015年4月，施一公研究组在PNAS发表论文，报道人源γ-分泌酶4.3埃的冷冻电镜三维结构。与一年之前的4.5埃结构相比，尽管分辨率只提高0.2埃，但是跨膜区密度质量有了极大提高。此外他们在PS1的N端连接T4-溶菌酶蛋白，从而准确定位出PS1的第一个跨膜螺旋，并在此基础上判断出四个亚基，验证了在2014年PNAS文章中推测的组装方式。此外，他们利用性质非常缓和的去污剂制备样品，证明电镜观察到的结构并未因蛋白纯化和冷冻制备而受到影响。这个结构也是清华大学电镜平台的K2电子探测相机自2014年暑期正常运转之后解析出的最小分子量的结构（Sun et al, PNAS）。

γ-分泌酶四个亚基跨膜区间的相互作用。

最新发表的Nature论文是施一公研究组与英国研究组合作的延续，在获得纯度好、性质均一的蛋白样品的基础上，通过收集更多的数据、大量的计算和升级的分类方法，计算构建出了3.4埃的原子分辨率的γ-分泌酶的三维结构，可以观察到绝大部分氨基酸的侧链以及胞外区部分糖基化修饰和结合的脂类分子。在高分辨结构的基础上，施一公研究组对PS1上的致病性突变体进行了研究，发现这些突变主要集中在两个较为集中的区域内，分别为跨膜区TM2-5以及TM6-9。他们对于其中一些突变体进行了生化性质的研究，发现这些突变会影响γ-分泌酶对于底物APP的酶切活性，然而对切割活性的影响却有所不同，因此对于已有的阿尔兹海默症的发病机理提出了一些新的探讨。

这项新的研究结果首次在世界上展示了γ-分泌酶的原子分辨率结构，并且在结构信息的基础上分析了人们关心的γ-分泌酶中催化亚基PS1上的致病性的突变，研究了突变体的生化活性，对于更进一步了解γ-分泌酶切割底物的机制以及研究阿尔兹海默症的发病机理具有极为重大的意义，也为开发潜在的治疗阿尔兹海默症的高效药物提供了重要的分子基础。

在清华大学生命学院隋森芳院士指导下获得博士学位后在英国MRC分子生物学实验室从事博士后研究的白晓晨博士、清华大学生命学院博士后闫创业与博士生杨光辉为本文共同第一作者。本工作获得了科技部、国家自然科学基金委以及生命科学联合中心的经费支持。